分光光度计的知识应用

分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及**生长浓度的定量。

仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。

分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比，其关系如下式:

A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc

式中 :A 为吸光度;

I。为入射的单色光强度;

I 为透射的单色光强度;

T 为物质的透射率;

k 为摩尔吸收系数;

L 为被分析物质的光程，即比色皿的边长;

c 为物质的浓度;

独特的双光路、双光束光学系统，仪器分辨率更高，杂散光更低，稳定性、可靠性更强，分析更加准确

采用320*240位点阵式高亮6 "液晶显示器，显示清晰，信息完备

独特的长光程光路设计，使仪器分辨率更高，尤其适合微量测试 强大的数据处理功能，使测试结果能得到充分的应用，用户编辑更为简单快捷

采用悬架式光学系统设计，整体光路独立固定在16mm厚的铝制无变形基座上，底板的变形和外界的震动对光学系统不产生任何影响，从而大大提高了仪器的稳定性和可靠性

采用同步正弦机构，波长准确度高，重复性好

采用ARM系统

0.1/0.2/0.5/1.0/2.0/4.0六档光谱带宽自动可选,满足不同用户的测量需求

24位高速、高精度A/D转换，仪器精度更高、反应速度更快

主要元件采用进口配置，使仪器杂散光更低、稳定性、可靠性更强

功能更加强大，主机可独立完成光度测量、定量测量、光谱扫描、动力学、DNA/蛋白质测试，多波长测试及数据打印等功能

充分考虑不同用户的使用习惯，本系列仪器都标配元析公司光谱扫描软件，联机操作时，除能实现主机的所有测试功能外，还可实现更为强大的数据处理功能，并且使数据存储达到无限

■仪器指标

型号UV-9000波长范围190-900nm光谱带宽0.1/0.2/0.5/1.0/2.0/4.0nm六档可选波长准确度±0.1nm(D2 656.1nm)， ±0.3nm全区域波长重复性≤0.1nm

光度准确度

±0.2%T光度重复性≤0.1%T杂散光≤0.01%T稳定性±0.0004A/h(500nm处)基线平直度

±0.001A

噪声水平 ±0.0004A/h光度范围0-200%T、-4.0-4.0A、0-9999C数据输出USB接口光学系统双光束、原装进口光栅显示系统320*240位高亮6"大屏幕LCD光源进口长寿命钨灯、氘灯检测器原装进口检测器外形尺寸635*440*210mm电源

AC 220V/50Hz或110V/60Hz

重量30kg技术参数

波长范围:320∽1000nm

光谱带宽:4nm

杂散光:≤0.5%(在360nm处)

波长准确度:优于±2nm

透射比准确度:≤±1nmT

常见用途

核酸的定量

核酸的定量是分光光度计使用频率*高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的*高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如:1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者***的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。

事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和**度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%(1A)。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等:在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了*大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值*好在0.1-1.5A。在此范围内混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的*小体积等多个操作事项。

除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。

1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。

2.将灵敏度开关调至"1"档(若零点调节器调不到"0"时，需选用较**。)

3.根据所需波长转动波长选择钮。

4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。

5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。

6.盖上暗箱盖，调节"100"调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。

7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。

注意事项

1.该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。

2.使用本仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操纵旋钮之功能。在未按通电源之前，应该对仪器的**性能进行检查，电源接线应牢固，通电也要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再按通电源开关。

3.在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于"0"刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。

日常维护

分析仪器工作者要懂得仪器的日常维护和对主要技术指标的简易测试方法，自己经常对仪器进行维护和测试，以保证仪器工作在*佳状态。

一、温度和湿度是影响仪器性能的重要因素。他们可以引起机械部件的锈蚀，使金属镜面的光洁度下降，引起仪器机械部分的误差或性能下降;造成光学部件如光栅、反射镜、聚焦镜等的铝膜锈蚀，产生光能不足、杂散光、噪声等，甚至仪器停止工作，从而影响仪器寿命。维护保养时应定期加以校正。应具备四季恒湿的仪器室，配置恒温设备，特别是地处南方地区的实验室。

二、环境中的尘埃和腐蚀性气体亦可以影响机械系统的灵活性、降低各种限位开关、按键、光电偶合器的可靠性，也是造成必须学部件铝膜锈蚀的原因之一。因此必须定期清洁，保障环境和仪器室内卫生条件，防尘。

三、仪器使用一定周期后，内部会积累一定量的尘埃，*好由维修工程师或在工程师指导下定期开启仪器外罩对内部进行除尘工作，同时将各发热元件的散热器重新紧固，对光学盒的密封窗口进行清洁，必要时对光路进行校准，对机械部分进行清洁和必要的润滑，*后，恢复原状，再进行一些必要的检测、调校与记录。

1)若大幅度改变测试波长，需稍等片刻，等灯热平衡后，重新校正"0"和"100%"点。然后再测量。

2)指针式仪器在未接通电源时，电表的指针必须位于零刻度上。若不是这种情况，需进行机械调零。

3)比色皿使用完毕后，请立即用蒸馏水冲洗干净，并用干净柔软的纱布将水迹擦去，以防止表面光洁度被破坏，影响比色皿的透光率。

4)操作人员不应轻易动灯泡及反光镜灯，以免影响光效率。

5)1900型等分光光度计，由于其光电接收装置为光电倍增管，它本身的特点是放大倍数大，因而可以用于检测微弱光电信号，而不能用来检测强光。否则容易产生信号漂移，灵敏度下降。针对其上述特点，在维修、使用此类仪器时应注意不让光电倍增管长时间暴露于光下，因此在预热时，应打开比色皿盖或使用挡光杆，避免长时间照射使其性能漂移而导致工作不稳。

6)放大器灵敏度换挡后，必须重新调零。

7)比色杯的配套性问题。比色杯必须配套使用，否则将使测试结果失去意义。在进行每次测试前均应进行比较。具体方法如下;分别向被测的两只杯子里注入同样的溶液，把仪器置于某一波长处，石英比色杯;220nm、700nm装蒸馏水，玻璃比色杯:700nm处装蒸馏水，将某一个池的透射比值调至100%，测量其他各池的透射比值，记录其示值之差及通光方向，如透射比之差在±0.5%的范围内则可以配套使用，若超出此范围应考虑其对测试结果的影响。

分光光度计分操作中容易出现的几个典型故障及其排除方法:

1)仪器不能调零。可能原因:

a)光门不能完全关闭。解决方法:修复光门部件，使其完全关闭。

b)透过率"100%"旋到底了。解决方法:重新调整"100%"旋钮。

c)仪器严重受潮。解决方法:可打开光电管暗盒，用电吹风吹上一会儿使其干燥，并更换干燥剂。

d)电路故障。解决方法:送修理部门，检修电路。

2)仪器不能调"100%"。可能原因:

a)光能量不够。解决方法:增加灵敏度倍率档位，或更换光源灯(尽管灯还亮)。

b)比色皿架未落位。解决方法:调整比色皿架使其落位。

c)光电转换部分老化。解决方法:更换部件。

d)电路故障。解决方法:调修电路。

3) 测量过程中,"100%"点经常变动。可能原因:

a)比色皿在比色皿架中放置的位置不一致，或其表面有液滴。解决方法:用擦镜纸擦干净比色皿表面，然后将其安放在比色槽的左边，上面用定位夹定位。

b)电路故障(电压、光电接收、放大电路)。解决方法:送修。

4)数显不稳。可能原因:

a)预热时间不够。解决方法:延长预热时间至30分钟左右(部分仪器由于老化等原因，长时间处于工作状态时，也会工作不稳)。

b)光电管内的干燥剂失效，使微电流放大器受潮。解决方法:烘烤电路，并更换或烘烤干燥剂。

c)环境振动过大、光源附近空气流速大、外界强光照射等。解决方法:改善工作环境。

d)光电管、电路等其它原因。解决方法:送修。

五、提高分光光度计透射比检定及使用精度的几种方法

在分光光度计的使用或检定中,透射比(吸光度)的准确度是衡量仪器工作性能的一项重要指标,它的准确程度直接关系到所测数据的可信性及科学性。所以提高此项指标的使用及检定准确度显得尤为重要。